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復雜注射劑之脂質(zhì)體的表征與解決方案
納米脂質(zhì)體 (nanoliposomes) 是一種具有類細胞膜磷脂雙分子層的納米囊泡體，因為磷脂層與細胞膜的結構類似，可以與細胞膜融合，從而將藥物送入細胞核中。脂質(zhì)體載體的釋藥機制，使其不但可以增加藥物溶解度，還具有潛在的緩釋或靶向特性，廣受研發(fā)人員的青睞，全球范圍內(nèi)已有 10 余種注射用脂質(zhì)體產(chǎn)品獲批上市。
納米藥物與其他藥物一樣，必須具有安全性、可控性與有效性，有效性是納米藥物實現(xiàn)疾病治療的基礎。脂質(zhì)納米注射劑經(jīng)給藥在體內(nèi)運轉時，需要克服多重生理/病理屏障，才能安全到達靶點發(fā)揮治療作用，在發(fā)揮其藥效前需要克服血液、組織、細胞和細胞器等多重屏障。[1]通過調(diào)控納米藥物本身的物理化學性質(zhì)，如納米藥物的大小、形狀、表面電荷等，一定程度上能夠克服藥物遞送障礙。[2]
相比于傳統(tǒng)注射劑，脂質(zhì)體具有靶向作用，可減輕藥物的毒副作用，機體器官對不同粒徑微粒的阻留能力不同，可通過脂質(zhì)體注射劑的粒徑控制實現(xiàn)藥物被動靶向效果。[3]脂質(zhì)體粒徑小于50nm時一般都能夠靶向至脾組織；在50~100nm時能靶向至肝組織；在0.1~0.2μm時能夠靶向至肝組織肝巨噬細胞的溶酶體；在7~12μm時可被肺組織細胞攝?。唬?/span>12μm時能夠被毛細血管上皮細胞攝取進而到達荷瘤組織內(nèi)；＞15μm時能被腸系膜動脈等血管上皮細胞攝取[4]。
脂質(zhì)體的粒徑直接影響藥物的釋放、生物利用度、載藥量、靶向性等，在制備時應控制粒子的大小，獲得較窄且均勻的粒度分布。
| 奧法美嘉平臺提供整套的脂質(zhì)體的表征及 解決方案，可用于快速評估、優(yōu)化脂質(zhì)體的配 方和工藝：PSI高壓微射流均質(zhì)機對脂質(zhì)體進行 制備和粒徑控制、Nicomp粒度分析儀分析平均 粒徑及Zeta電位的檢測、AccuSizer顆粒計數(shù)器 分析大粒子濃度，Lumispoc顆粒計數(shù)器分析小粒子濃度、Lum穩(wěn)定性分析儀快速分析脂質(zhì)體的 穩(wěn)定性，Entegris-ANOW濾芯過濾雜質(zhì)及大顆粒。 |
在脂質(zhì)體的制備方法中有多種制備方法，傳統(tǒng)的方法如：薄膜水化法、溶劑注入法、逆向蒸發(fā)法等。這些方法幾乎都是先將脂質(zhì)溶解在有機溶劑中，然后再去除有機溶劑。另外，也有大量的非傳統(tǒng)制備方法用于研究，如超臨界流體(supercritical fluid, SCF)、微流體技術、冷凍干燥法。此處，介紹一種脂質(zhì)體的制備流程，見圖1，通過傳統(tǒng)方法制備粒徑比較大的粗脂質(zhì)體，在除去有機溶劑后，再通過微射流均質(zhì)的方式進一步降低粒徑及進行整粒；而后通過超濾進行純化，得到粒徑均一、滿足使用安全要求的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的平均粒徑和粒度分布是脂質(zhì)體藥品關鍵質(zhì)量特性，顯著影響其體內(nèi)行為。溶解磷脂可能需要用到毒性比較大的有機溶劑，溶劑殘留需要符合ICH相關規(guī)定，除去可能存在困難。超濾是影響粒徑和溶劑殘留的關鍵工藝，也是達到控制的最后一步工藝。[5]
圖1 脂質(zhì)體制備與表征流程圖
脂質(zhì)體粒度控制
脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)屬于非均相熱力學不穩(wěn)定系統(tǒng)，脂質(zhì)體在制備過程中，若粒徑大小及分布不合格，則會影響產(chǎn)品 后續(xù)質(zhì)量問題。粗脂質(zhì)粒需要經(jīng)過高壓均質(zhì)或微射流進行整粒，而后進行超濾純化，得到粒徑均一的脂質(zhì)體。高壓微 射流均質(zhì)機具有大規(guī)模、連續(xù)化生產(chǎn)等特點，通過高速撞擊、剪切與空穴作用達到均質(zhì)與細化的目的，現(xiàn)已有用于制 備阿糖苷、中鏈脂肪酸、茶多酚及維生素C等納米脂質(zhì)體的實例。[6]
高壓微射流均質(zhì)機
PSI-20高壓微射流均質(zhì)機（小試兼中試型）采用固定 結構的均質(zhì)腔，通過電液傳動的增壓器使物料在高壓作 用下以極大的速度流經(jīng)交互容腔的微管通道，物料流在 此過程中受到高剪切力、高碰撞力、空穴效應等物理作 用，使得平均粒徑降低、體系均一穩(wěn)定，由此獲得理想 的均質(zhì)、分散、去團聚的結果。
● 最高2069 bar的均質(zhì)壓力，最高處理量20L/h （PSI- 20） ● 采用特殊設計Y型腔，去除尾端大顆粒效果佳，物料 的混合更均一，處理效率高。 ● 屏顯界面，數(shù)據(jù)可溯源：支持數(shù)據(jù)導出設定壓力及實 時壓力、監(jiān)測點溫度、實時流量、時間等。 ● 配置K型熱電偶：可用于實施監(jiān)測料液溫度。 ● 低噪音：運行音量低于70分貝，工作環(huán)境友好型。 |
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脂質(zhì)體理化性質(zhì)評價通常包括粒徑大小及分布均勻程度、穩(wěn)定性及包封率等方面。粒徑大小及分布除與其包封率及穩(wěn)定性有關外，同時對載藥脂質(zhì)體的治療效果有直接的影響。因物理和生理作用，機體能夠選擇性地在肝、脾、肺、淋巴等部位聚集不同大小的載藥脂質(zhì)體，從而使其釋放藥物發(fā)揮藥效。[7]此外，還可以通過檢測Zeta電位對脂質(zhì)體穩(wěn)定性進行評價，Zeta電位越高，體系更加穩(wěn)定。
Nicomp納米激光粒度儀系列 Nicomp系列納米激光粒度儀采用動態(tài)光散射原理檢測分析樣品的粒度分布，基于多普勒電泳光散射原理檢測ZETA電位。
l 粒徑檢測范圍0.3nm-10μm，ZETA電位檢測范圍為+/-500mV l 搭載Nicomp多峰算法，可以實時切換成多峰分布觀察各部分的粒徑。 l 高分辨率的納米檢測，Nicomp納米激光粒度儀對于小于10nm的粒子仍然現(xiàn)實較好的分辨率和準確度。 |
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采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipidfilm hydration（脂膜水化反法）方式制備脂質(zhì)體，對過濾 擠出工藝前后樣本脂質(zhì)體用Nicomp 3000設備進行粒度檢 測，測試結果如表1所示。
| Before Extrusion | After Extrusion through 0.4μm Filter (3 times) |
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| After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times) | After Extrusion through 0.1μm Filter (3 times) |
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表1 GMV法制備脂質(zhì)體過濾前后粒徑分布圖（Gaussian 分布）
由表1可知，沒有過濾擠出前Gaussian分布下平均體積徑為1237nm；經(jīng)過0.4μm、0.2μm、0.1μm過濾器過濾擠出3次后，平均體積徑為219nm、161nm、101nm；平均粒徑明顯降低。其Nicomp 分布如表2所示。通過Nicomp分布可真實反映脂質(zhì)體粒徑分布情況，由表2中可知，未擠出脂質(zhì)體體積粒徑Nicomp分布有三個峰；經(jīng)過0.4μm過濾器擠出后三個峰的粒徑均減小，經(jīng)過0.2μm過濾器過濾之后變?yōu)閱畏?，?jīng)過0.1μm過濾器過濾之后獲得分布更加窄的單峰。
Before Extrusion | After Extrusion through 0.4μm Filter (3 times) |
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| After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times) | After Extrusion through 0.1μm Filter (3 times) |
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表2 GMV法制備脂質(zhì)體過濾前后粒徑分布圖（Nicomp 分布）
對比Gaussian及Nicomp分布結果可知：Gaussian分布可整體反應脂質(zhì)體粒徑分布情況；而Nicomp分布更真實反映脂質(zhì)體粒徑分布。通過Nicomp數(shù)據(jù)的分析可以更好的幫助脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化，選擇合適的處理方式得到想要的粒徑范圍樣本。
用作載藥功能的脂質(zhì)體平均粒徑一般為亞微米級別或納米級別，但仍存在微米級別的脂質(zhì)體粒子，尾端大顆粒的存在往往會吸附小顆粒，影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，分析尾端大粒子濃度和數(shù)量可以評價當前配方和工藝的情況并做出相應優(yōu)化，例如用作佐劑的脂質(zhì)體一般檢測0.8μm~10μm之間的大顆粒分布，以確保工藝的穩(wěn)定。為確保納米藥物的有效性，還需控制小粒子的濃度，過小的脂質(zhì)體粒子容易被腎臟清除到尿液排出，無法起到治療作用。[8]
AccuSizer顆粒計數(shù)器系列 AccuSizer系列在檢測液體中顆粒數(shù)量的同時精確檢測顆粒的粒度及粒度分布，通過搭配不同傳感器、進樣器，適配不同的樣本的測試需求，能快速而準確地測量顆粒粒徑以及顆粒數(shù)量/濃度。
l 檢測范圍為0.5μm-400μm（可將下限拓展至0.15μm）。 l 0.01μm的超高分辨率，AccuSizer系列具有1024個數(shù)據(jù)通道，能反映復雜樣品的細微差異，為研發(fā)及品控保駕護航。 l 靈敏度高達10PPT級別，即使只有微量的顆粒通過傳感器，也可以精準檢測出來。 |
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AccuSizer系列用于脂質(zhì)體粒徑檢測案例
采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipid-film hydration（脂膜水化反法）方式制備脂質(zhì)體，對過濾擠出 工藝前后樣本脂質(zhì)體用AccuSizer A7000設備進行粒度檢測，測試結果如表3所示。
| After Centrifugation | After Extrusion through 10.0μm Filter (1 time) |
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| After Extrusion through 5.0μm Filter (1 time) | After Extrusion through 3.0μm Filter (1 time) |
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表3 GMV法制備脂質(zhì)體過濾擠出后粒徑分布圖
由表3可知，上面藍色譜圖為數(shù)量粒徑分布結果，下面紅色譜圖為體積粒徑分布測試結果。分別對制備的脂質(zhì)體樣品用 10μm、5μm、3μm過濾器過濾，經(jīng)過10μm、5μm、3μm過濾器的數(shù)量粒徑分布比未過濾前濃度更低，但數(shù)量粒徑分布 差異不大；觀察體積粒徑分布，可知：經(jīng)過10μm、5μm過濾器過濾后，體積占比中大于等于10μm顆粒明顯減少；經(jīng)過 3μm過濾器過濾后，10μm顆粒體積占比進一步減少，且主峰已不在10μm處，尾端大顆粒明顯減少。
穩(wěn)定性是評估藥物的常規(guī)項，脂質(zhì)體穩(wěn)定性影響存放時間和有效期，穩(wěn)定性較差的脂質(zhì)體會導致藥物療效降低或副作用增加，有的藥物甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)?？刂莆捕舜罅Ｗ訑?shù)量和濃度能有效提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，此外，粒徑分布較窄的脂質(zhì)體穩(wěn)定性也較好。
LUM穩(wěn)定性分析儀
LumiFuge穩(wěn)定性分析儀可以直接測量整個樣品的分散體的穩(wěn)定性，檢測和區(qū)分各種不穩(wěn)定現(xiàn)象，如上浮、絮凝、聚集、聚結、沉降等，通過測量結果可用來開發(fā)新的配方和優(yōu)化現(xiàn)有的配方及工藝。 l 快速、直接測試穩(wěn)定性，無需稀釋，溫度范圍寬廣 l 可同時測8個樣品，測量及辨別不同的不穩(wěn)定現(xiàn)象及不穩(wěn)定性指數(shù) l 加速離心，最高等效2300倍重力加速度 |
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粗脂質(zhì)體經(jīng)高壓微射流等設備整粒之后，需經(jīng)過超濾才能得到最終的脂質(zhì)體成品。超濾是以壓力為推動力的膜分離技術之一，優(yōu)點是沒有相轉移，無需添加任何強烈化學物質(zhì)，可以在低溫下操作，過濾速率較快，便于做無菌處理等。超濾技術的關鍵是濾膜，濾膜有各種不同的類型和規(guī)格，綜合考量物理攔截，吸附攔截等效果，選擇適配的濾膜材質(zhì)用于過濾。
Entegris濾芯
Entegris-Anow是一家高分子微孔膜過濾企業(yè)，專業(yè)從事MCE、Nylon、PES、PVDF、PTFE等（膜孔徑為0.03μm~10μm）微孔膜的研發(fā)及生產(chǎn)，具有二十多年服務與醫(yī)藥客戶經(jīng)驗，并為全球生物制藥、醫(yī)療器械、食品飲料、實驗室分析、微電子及工業(yè)等領域的客戶提供過濾、分離和凈化解決方案。
Entegris與Anow的結合，引 入Entegris質(zhì)量管理體系，每一支濾芯都經(jīng)過嚴格檢查，此外，新建成的CTC驗證中心，為全球客戶提供專業(yè)的驗證服務。 |
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參考資料：
[1] 張燦.聚焦納米治療藥物的成藥性[J].藥學進展,2018,42(11):801-803
[2] 王宇馨. 磷酸錳礦化納米藥物及其抑癌作用研究[D].浙江理工大學,2022.
[3] 高諧,丁楊,周建平.脂質(zhì)納米注射劑的研究與應用前景[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2019,50(10):1098-1112.
[4] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質(zhì)體的藥理學評價[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2023,39(01):137-140.
[5] 脂質(zhì)體關鍵工藝之擠出和超濾
[6] 陳瓊玲,劉紅芝,劉麗,王強.高壓微射流法制備白藜蘆醇納米脂質(zhì)體[J].核農(nóng)學報,2015,29(05):916-924.
[7] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質(zhì)體的藥理學評價[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2023,39(01):137-140.
[8] Fukumura D, Kloepper J, Amoozgar Z, et al. Enhancing cancer immunotherapy using antiangiogenics: opportunities and challenges[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018, 15(5):325-340
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